● 期刊：Hepatology
● IF=14.971
● 發(fā)表時(shí)間：2019-08-23
實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
靶向膽汁酸檢測(cè)、16s RNA、生理生化檢測(cè)及qPCR
研究思路
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)影響大約20%到30%的世界人口，是導(dǎo)致終末期肝病、癌癥的主要原因。盡管如此，被稱為“瘦非酒精性脂肪肝”或“瘦患者非酒精性脂肪肝”實(shí)體的存在和臨床進(jìn)程一直是激烈辯論和爭(zhēng)議的主題。“瘦非酒精性脂肪性肝病”指的是在正常體重指數(shù)(BMI)的情況下表現(xiàn)出疾病。越來(lái)越多的證據(jù)表明，瘦型非酒精性脂肪性肝病可能是一種獨(dú)特的病理生理學(xué)實(shí)體，其中大約一半(47%-65%)患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。瘦型非酒精性脂肪性肝病的自然史特征更不明顯，與肥胖的非酒精性脂肪性肝病相比，其發(fā)病機(jī)理和機(jī)制令人困惑且了解不多，瘦型非酒精性脂肪性肝病的治療方案仍未確定。
對(duì)于代謝體內(nèi)平衡，除了神經(jīng)內(nèi)分泌軸、熱量攝入和體力活動(dòng)外，腸肝循環(huán)，包括膽汁酸(BAs)及其代謝物和腸道微生物群也密切相關(guān)。膽汁酸是膽固醇分解代謝的主要途徑，最近的證據(jù)表明，膳食膽固醇的高攝入、肝膽固醇水平的升高和肝膽固醇穩(wěn)態(tài)的破壞是非酒精性脂肪肝的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。有研究表明，與肥胖的非酒精性脂肪肝相比，瘦型的膽固醇攝入量更高。膽汁酸還調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)代謝以及能量消耗，而它們的生產(chǎn)、運(yùn)輸和代謝又由特定的核膽汁酸受體FXR和FGF19調(diào)節(jié)，這可能是通過(guò)依賴和獨(dú)立的機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。腸道微生物群也與多種代謝疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，包括體重調(diào)節(jié)、非酒精性脂肪肝和肝癌，部分是通過(guò)與膽汁酸的直接作用。
本研究針對(duì)臨床瘦型、肥胖型非酒精性脂肪肝患者和瘦型正常人以及動(dòng)物模型的研究，證實(shí)了腸道菌群及膽汁酸在不同類型的非酒精性脂肪肝中的差異及作用。
研究結(jié)果
1.瘦型NAFLD的臨床和遺傳學(xué)特征
本研究共招募了538例經(jīng)活檢證實(shí)為NAFLD的患者，有99人(18%)是瘦人。除了低BMI,相較于非瘦型患者，瘦型患者有更低的腰臀比(WHR)和更良好的代謝狀況,包括糖尿病頻率、高血清高密度脂蛋白(HDL)、血清甘油三酯、空腹血糖和內(nèi)穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估胰島素抵抗(HOMA-IR)值等。組織學(xué)上，瘦患者的纖維化評(píng)分和NAFLD活性評(píng)分較低，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)較低。總的來(lái)說(shuō)，與非瘦性NAFLD相比，瘦性NAFLD具有良好的代謝和組織學(xué)特征。
瘦型非酒精性脂肪肝患者攜帶TM6SF2 rs58542926 (T)等位基因的患病率明顯高于非瘦型患者，但PNPLA3 GG多態(tài)性的患病率相似。在一個(gè)多變量模型中，矯正年齡、性別、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、糖尿病、總膽固醇水平、纖維化、脂肪變性和PNPLA3基因型因素，但TM6SF2 rs58542926 (T)等位基因仍然與瘦型NAFLD相關(guān)。
2. 血清膽汁酸與NAFLD的嚴(yán)重程度有關(guān)
膽汁酸與NAFLD纖維化分期的關(guān)系。所有膽汁酸在無(wú)/輕度纖維化和明顯纖維化患者之間的分布如圖1A所示。顯著纖維化(≥F2)患者的總膽汁酸水平、初級(jí)膽汁酸水平和次級(jí)膽汁酸水平均高于無(wú)/輕度纖維化(F0-F1)患者(圖1B)。在個(gè)體膽汁酸水平上，顯著纖維化患者的膽汁酸水平明顯高于無(wú)/輕度纖維化患者(圖1C)。同樣，顯著纖維化患者的甘氨酸和牛磺酸結(jié)合態(tài)膽汁酸水平顯著高于無(wú)/輕度纖維化患者(圖1D,E)。膽汁酸水平和纖維化之間的關(guān)系仍然是通過(guò)多變量線性回歸分析矯正年齡、BMI、性別、糖尿病、ALT和血小板等因素。
圖1
3.瘦NAFLD患者血清膽汁酸水平較高
接下來(lái)，探討瘦型和非瘦型NAFLD患者膽汁酸的差異。有趣的是，與非瘦NAFLD患者相比，瘦型NAFLD患者的總膽汁酸、初級(jí)性和次級(jí)性膽汁酸水平更高，其中次級(jí)膽汁酸呈顯著差異(圖2B)。瘦型NAFLD患者與非瘦型NAFLD患者個(gè)體的膽汁酸組成也存在差異，其中瘦患者的脫氧膽酸(DCA)、糖基脫氧膽酸(GCDCA)、糖基脫氧膽酸(CDCA)較低，而糖基膽酸(GCA)較非瘦患者較多(圖2A)。與非瘦型NAFLD患者相比，瘦型NAFLD患者的總結(jié)合態(tài)膽汁酸和總非結(jié)合態(tài)膽汁酸均無(wú)顯著性升高。
鑒于膽汁酸譜與纖維化的相關(guān)性強(qiáng)，還研究了纖維化分期、膽汁酸與瘦型NAFLD的關(guān)系。當(dāng)以這種方式分析時(shí)，在輕度纖維化(F0-F1)患者中，與非瘦性NAFLD患者相比，瘦性NAFLD患者的總次級(jí)膽汁酸水平更高。在纖維化程度較重的患者中，瘦型和非瘦型患者無(wú)顯著差異(圖2C,D)。造成這種差異的主要是次級(jí)膽汁酸為DCA和UDCA(圖2E,F)。
在隨后的分析中，確定了與次級(jí)膽汁酸水平相關(guān)的臨床因素。一致地，在單變量分析中，BMI、纖維化和腫脹與次級(jí)膽汁酸水平相關(guān)。在多變量分析中，只有BMI和纖維化階段獨(dú)立地與次級(jí)膽汁酸水平呈負(fù)相關(guān)和正相關(guān)。
圖2
4.瘦型NAFLD患者血清FGF19水平較高
FXR失調(diào)與NAFLD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)；因此，作者需要確定瘦型NAFLD和非瘦型NAFLD是否存在差異效應(yīng)。為了檢驗(yàn)這一點(diǎn)，測(cè)定了FXR活性的替代標(biāo)記血清FGF19。在本分析中，F(xiàn)GF19水平隨著纖維化程度的進(jìn)展而降低(圖3A)。瘦型NAFLD患者的FGF19水平明顯高于非瘦型NAFLD患者(圖3B)。有趣的是，當(dāng)按纖維化嚴(yán)重程度分類時(shí)，輕度纖維化(F0-F1)的差異更大，隨著纖維化嚴(yán)重程度的增加，反之亦然；然而，這并不顯著(圖3C)。
圖3
5.瘦型NAFLD患者C4（7-alpha-hydroxy-4-cholesten-3-one）水平較低
為了研究瘦型和非瘦型NAFLD中膽汁酸代謝的差異，測(cè)定了膽汁酸合成中間體C4的含量，作為從頭合成膽汁酸的標(biāo)志。本分析中，根據(jù)纖維化分期，C4水平無(wú)差異(圖3D)。然而，正如預(yù)期的那樣，與非瘦型NAFLD患者相比，瘦型NAFLD患者的C4水平顯著降低(圖3E)。這種差異在輕度纖維化(F0-F1)患者中更為明顯，而在中度/重度纖維化(F2-F4)患者中則不明顯(圖3F)。瘦型NAFLD患者有獨(dú)特的微生物群分布。
腸道微生物群的組成及其與膽汁酸的相互作用影響著FXR介導(dǎo)的肝臟和腸道信號(hào)通路，并與NAFLD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。在門水平上，根據(jù)瘦與肥胖的BMI狀況，腸道微生物組的分類組成沒(méi)有差異。在屬水平上，Erysipelotrichaceae UCG-003以及梭菌目中的幾個(gè)細(xì)菌屬，包括Ruminococcus, Clostridium sensu stricto 1, Romboutsia, 以及Ruminococcaceae UCG-008，這些菌群在瘦型患者中豐度較高，而Ruminiclostridium和Streptococcus在肥胖型患者中豐度較高（圖4）。
圖4
6.與瘦型健康人相比，瘦型NAFLD患者有不同的膽汁酸譜和微生物群分布
與瘦型健康人相比，瘦型NAFLD患者的總膽汁酸、初級(jí)膽汁酸和次級(jí)膽汁酸均顯著升高。瘦型健康人與無(wú)/輕度纖維化的瘦型NAFLD患者FGF19水平無(wú)顯著差異(F0-F1)。然而，在中度/重度纖維化(F2-F4)的瘦型NAFLD患者中，F(xiàn)GF19水平明顯低于瘦型健康人。對(duì)微生物群的分析表明，瘦型健康人和瘦型NAFLD有很大差別，瘦型NAFLD患者Dorea的豐度增加，而Marvinbryantia 和 Christensellenaceae R7豐度降低。
7.小鼠瘦型NAFLD模型膽汁酸含量增加，腸道菌群發(fā)生改變
為了進(jìn)一步驗(yàn)證假設(shè)，研究了瘦型和非瘦型NAFLD小鼠模型中膽汁酸水平和腸道微生物群的變化。小鼠被喂食高膽固醇(ChR)或高蔗糖食物16周。與之前的研究一致，喂食ChR飼料的小鼠盡管發(fā)生NAFLD，但仍然保持瘦的體型，而喂食高蔗糖飼料的小鼠體重顯著增加。組織學(xué)圖像如圖5A所示。與我們的人類實(shí)驗(yàn)結(jié)果一樣，喂食ChR飼料的小鼠的總膽汁酸、初級(jí)膽汁酸和次級(jí)膽汁酸均顯著升高(圖5B)。回腸fgf15(與人類FGF19相當(dāng))的分析顯示，與高蔗糖飲食相比，喂食ChR的小鼠回腸fgf15的水平顯著升高(圖5C)。
對(duì)微生物群落的分析表明，組成發(fā)生了變化，這廣泛反映在兩個(gè)主要門——厚壁菌門和擬桿菌門，以及放線菌門、藍(lán)細(xì)菌門和變形菌門——相對(duì)豐度的顯著變化上。與高蔗糖喂養(yǎng)的小鼠相比，ChR喂養(yǎng)的小鼠的擬桿菌門相對(duì)豐度增加，厚壁菌門減少(圖5D)。人類身上同樣的趨勢(shì)也被注意到，在喂食高膽固醇飲食(瘦型NAFLD)的小鼠中，乳球菌科的數(shù)量豐富。
圖5
8.在瘦非酒精性脂肪性肝病模型中，抑制膽汁酸再吸收可改善脂肪性肝炎
最后，為了研究本結(jié)果的治療意義，對(duì)ChR日糧喂養(yǎng)的小鼠(瘦型NAFLD)進(jìn)行了添加或不添加膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(ASBTi) (SC-435)的治療，該抑制劑介導(dǎo)膽汁酸主動(dòng)重吸收進(jìn)入腸肝循環(huán)。補(bǔ)充SC-435可降低肝臟/體重比、肝臟總膽固醇和游離膽固醇積累，但不影響身體或附睪重量。組織學(xué)上，SC-435治療降低了炎癥和纖維化，降低了非酒精性脂肪肝活性評(píng)分（NAS） (圖6B)和血清ALT水平(圖6C)。與預(yù)期一樣，炎癥和纖維化標(biāo)志物的信使RNA (mRNA)表達(dá)降低(圖6D)。在進(jìn)一步的分析中，SC-435治療導(dǎo)致膽汁酸譜發(fā)生改變，F(xiàn)XR激動(dòng)劑膽汁酸(如DCA和TDCA)升高 (圖6E)，回腸fgf15水平升高，參與調(diào)控膽汁酸的視黃質(zhì)X受體(RXR)、FXR等在肝臟中的mRNA表達(dá)上升(圖6E)。有趣的是，與對(duì)照小鼠相比，喂食SC-435增加了小鼠的盲腸重量并改變了腸道微生物群，增加了類桿菌的相對(duì)豐度，并降低了拉克氏菌科的相對(duì)豐度(圖6F)。
圖6
最后如下圖所示，展示了瘦型和肥胖型NAFLD患者的病理生理學(xué)差異模型。瘦患者具有較好的代謝和肝臟組織學(xué)特征。瘦患者對(duì)導(dǎo)致體重增加的環(huán)境有適當(dāng)?shù)拇x適應(yīng)，這與瘦患者對(duì)肥胖有抵抗能力的觀點(diǎn)是一致的。補(bǔ)償性機(jī)制包括膽汁酸和FXR活性的增加，以及獨(dú)特的腸道微生物群分布，這些解釋了脂肪變性發(fā)展過(guò)程中有利的分布。在瘦型和肥胖型NAFLD小鼠模型中也觀察到類似的特征。
轉(zhuǎn)載于小邁 邁維代謝
浙公網(wǎng)安備33010802007965號(hào)