靶向代謝組學屬于代謝組學的一個分支，代謝組學和基因組學、蛋白組學等共同組成系統(tǒng)生物學大家庭，如下圖：
從代謝組學的角度，靶向代謝組開發(fā)是基于廣靶分析的再次驗證，也就是對生物機體中廣泛篩查后的物質成分，給出準確的定量分析結果。主要針對生物機體中分子量小于1000的特定物質或特定類型的成分，包含機體各種代謝途徑下的中間產物、底物和或相關標志物，比較常見的類型如氨基酸、核苷酸、糖類、脂肪酸、膽汁酸、氧化脂質等等。
靶向代謝組方法開發(fā)常用的有絕對定量和相對定量，其區(qū)別在于絕對定量需配制不同梯度的已知濃度標準品，繪制標準曲線計算出準確的含量，而相對定量則無需提供標準曲線及計算準確含量，僅提供目標成分的響應即可。
如何建立科學的靶向代謝組學分析方法？
一般而言，完整的靶向方法開發(fā)包含文獻調研，樣品前處理開發(fā)，儀器方法開發(fā)，方法學驗證等環(huán)節(jié)。
下面以基于質譜分析建立靶向代謝方法學開發(fā)進行說明。
文獻調研
查閱國內外學術期刊，分析樣品處理方法、檢測方法、定量限等，核心的目標是確定方法開發(fā)的可行性并給出實驗方案。后續(xù)的開發(fā)過程，都基于文獻調研的結果。
首先確定樣本的類型和待分析物的類別。每種類別都有各自的理化性質和特點。
其次，文獻查詢的關鍵詞要準確規(guī)范，目的就是為了保證文獻查詢的精準、全面。文獻搜索的范圍，包括中英文期刊論文、國家標準或行業(yè)標準、相關專利等。如下圖顯示的是常用的幾個搜索工具或數(shù)據(jù)庫：
圖1 知網(wǎng)查詢
圖2 SCI-HUB查詢
圖3 PubMed查詢
圖4 國家標準查詢
除此之外，還有百度學術，谷歌學術，Web of science，chemspider，pubchem等網(wǎng)上資源，相關的文獻資料也很多。
文獻篩選也需要考慮其權威性，同時關注相關領域最權威的實驗室和最新的研究文章。
樣品前處理開發(fā)
由于生物樣品的基質復雜，待分析物的含量較低（一般為ng/L或μg/L）,因此對方法的靈敏度和精密度有著更高的要求，那么樣品前處理就顯得尤為重要。通常，前處理優(yōu)化包含取樣量、提取溶劑、提取方式、樣品凈化或濃縮等。
取樣量根據(jù)樣本特性選擇，也根據(jù)待分析目標確定，血漿、組織、細胞、尿液等都有常規(guī)的取樣原則。
提取溶劑的選擇主要依據(jù)物質的理化信息，可以綜合各種文獻的結果進行確認，同時需要明確并注意的是樣品提取環(huán)節(jié)，是否需要避光？是否需要低溫環(huán)境？是否需要增加穩(wěn)定劑（如抗氧化、調節(jié)酸堿度）？等等。
如果目標物在樣品含量極低，或目標物受基質干擾較大，需要考慮樣品的富集或純化，常見的方法如溶劑萃取、過固相萃取小柱、大孔樹脂純化、脫脂處理等，具體方案依照文獻查詢的結果綜合考慮。
有時為了提高待分析物的可檢測性，可考慮衍生化處理。如用GC-MS方法開發(fā)糖類成分、脂肪酸類成分時，就需要考慮采用衍生化試劑處理。
樣品前處理方案，是要在保證提取完全的基礎上，避免目標物的降解、轉化，降低基質干擾，以提高方法的靈敏度。但對于大批量樣品的分析，前處理方法還需要考慮過程的簡單，避免過多的試劑和提取過程引入的誤差。下圖所示為常見的幾種前處理方法。
檢測方法開發(fā)
檢測方法開發(fā)和樣品前處理開發(fā)是緊密相關的環(huán)節(jié)，這里以LC-MS/MS為例進行說明（注：LC-MS/MS是代謝組研究中最為常用的方法），主要分兩個部分：一是色譜方法，二是質譜方法。
1.色譜方法開發(fā)
首先需要決定的是色譜柱類型。常用的是C18色譜柱，特定類型的成分，可以選擇其他極性色譜柱如氨基柱、氰基柱、糖柱等，具體可以參照相關專業(yè)書籍進行選擇。
其次需要確定流動相和梯度體系，流動相的選擇和待分析物酸堿性相關。一般而言，酸類成分，流動相中添加乙酸、甲酸等，可以改善拖尾；堿性成分，主要添加氨水等；對酸堿敏感的目標物，一般在流動相中添加緩沖鹽。梯度的選擇也根據(jù)目標物性質進行開發(fā)。
文獻資料中的方法不能完全照搬，在實際開發(fā)的過程中需要進行優(yōu)化，因為色譜柱品牌不同、儀器性能不同，流出曲線是有差異的，需要根據(jù)實驗情況選擇最為合理的方案，保證待測目標成分和干擾物相互分離，保證較好的響應，以及調整流動相比例優(yōu)化最佳的出峰時間。
需要特別注意的是，HPLC方法中的流動相并不是都能直接轉移到質譜端，難揮發(fā)或不能揮發(fā)的緩沖鹽進入質譜后，容易在離子源處形成結晶體，甚至損壞質譜硬件。如果采用UPLC方法代替HPLC方法，色譜柱、流動相、流速、進樣量都應該相應調整。
2.質譜方法開發(fā)
質譜開發(fā)多針對的是三重四級桿質譜，這里涉及到母離子Q1的確認和碎片離子Q3等信息，所以一般而言，質譜方法開發(fā)的第一步是建立標準品的質譜方法，通常可通過針泵進樣的方式確定離子對信息和檢測參數(shù)。
例如分析樣品中維拉帕米，在文獻查閱環(huán)節(jié)，已明確目標物的分子式、結構式、溶解性。見下圖
（圖片來自 AB SCIEX）
通過針泵直接進樣（大致1ppm濃度），在Q1環(huán)節(jié)，確定找到標準品的母離子。這里要特別注意的是，母離子有很多加合形式，如M+H、M-Cl、M-Na等，所以在判斷母離子時，不能僅依照物質的摩爾分子量，還需要考慮目標物的電離特性。在對母離子響應不確定的時候，可以增加梯度濃度的標準品，觀察峰面積是否等比例增加。
找到母離子后，需通過調節(jié)碰撞能CE，確定碎片離子，即子離子。為了提高子離子的響應，需進一步對碰撞能CE和去簇電壓DP等參數(shù)進行優(yōu)化。碰撞能CE不同，碎片的相對豐度不同，根據(jù)最大響應值，選擇最佳的碰撞能。去簇電壓DP是為了消除溶劑離子簇，DP越大，去簇效果越好，DP太大會造成離子源內裂解。
質譜參數(shù)的選擇還有很多，可以根據(jù)實際情況調整，不同的儀器有不同的最佳參數(shù)，主要目的是保證待分析物有最佳的響應值。離子對的選擇一般至少2組，一組作為定量離子，一組作為定性離子。
標準品開發(fā)環(huán)節(jié)，還涉及內標物質的確定，一般而言，最好的內標物是同位素內標，與標準品有相同的色譜行為，相同的基質效應，可以更為準確的實現(xiàn)目標物的絕對定量。
標準品開發(fā)完成后，可以進行實際樣品的預實驗，確定樣品中目標物的大致范圍，優(yōu)化色譜梯度比例，根據(jù)響應值調整進樣量、進樣濃度等信息，同時觀察是否有基質干擾，是否需要進一步純化等等。
方法學驗證（僅針對絕對定量方法）
任何方法的開發(fā)和應用，都需要一個評價標準，或是一個指導原則，來確定方法的可行性和準確性。質譜分析多涉及生物樣品，藥典附錄中《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》便是一個重要方法學驗證參照。這里面定義了方法學考察的要求，也規(guī)定了質控指標。
要提交完整的開發(fā)方案，方法學驗證中至少應該涉及：標準曲線（線性關系）、檢出限和定量限、回收率、日內日間精密度等。
標準曲線需要盡量涵蓋待測樣品的含量區(qū)間，一般覆蓋三個數(shù)量級，并滿足相關系數(shù)在合理的范圍，如下圖。建立標準曲線的同時，也需要給出定量限和檢出限指標，定量限（LOQ）以10倍噪音為基準。
回收率主要是考察方法的可靠性，一般達到80%-120%之間為宜，由于生物樣品的復雜性，存在復雜基質干擾的情況下，待分析物質含量極低的情況下，回收率范圍可以適當放寬。
日內日間精密度，為均勻樣品多次重復測定所得結果的一致性，在一天之內進行的精密度考察稱為日內精密度；在三天之內進行的精密度考察稱為日間精密度。
總結
以上是靶向代謝組方法開發(fā)的一個基本流程。實際的開發(fā)中往往更復雜，可能還涉及質控指標的建立，數(shù)學建模分析，報告輸出等等。
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