文章題目為Strategy for Global Profiling and Identification of 2-and 3-Hydroxy Fatty Acids in Plasma by UPLC-MS/MS ，是由中國醫學科學院藥物研究所的再帕爾教授課題組近期發表在Analytical Chemistry上的一篇文章。
研究背景
脂肪酸是體內一類重要的脂類成分，參與機體眾多代謝過程，包括細胞凋亡，信號轉導、胰島素抵抗以及能量代謝等。除了大多數的直鏈脂肪酸外，還有一些脂肪酸的衍生物（包括支鏈脂肪酸、羥基脂肪酸等）在生物體的代謝過程中也發揮著重要作用。本研究中，作者的關注點就集中在羥基脂肪酸上，這類化合物與脂肪酸的氧化有密切聯系。
羥基脂肪酸（OHFA）的分類：最常見的形式為2-羥基脂肪酸（2-OHFAs）和3-羥基脂肪酸（3-OHFAs）兩類。盡管這類化合物在機體中發揮重要作用，但是由于其在體內濃度較低，在分析時通常會被忽略。
檢測方法：
基于質譜的鳥槍法：通過對C=C雙鍵或者羧基進行衍生，達到區分異構體的目的，但是脂質提取物直接注入帶來的離子抑制作用影響了低濃度脂肪酸的檢測。
氣質聯用：通常需要對樣本進行甲酯化，但是衍生化的操作費時費力，還會引入multi-origination和multipeak 現象，進而影響定量分析的準確性。
液質聯用：擁有高靈敏度和高選擇性，已建立了一些方法用于羥基脂肪酸的檢測，但是由于標準品的缺乏，這些方法只關注了一小部分2-OHFAs或3-OHFAs。
目前還沒有一個方法能夠同時對2-OHFAs和3-OHFAs進行檢測，本研究就將使用LC-MS/MS技術建立方法，同時對生物樣本中的2-OHFAs和3-OHFAs進行全面檢測分析。
實驗流程：
分析2-OHFAs和3-OHFAs的串聯質譜圖，尋找特征離子，建立包含母離子信息和子離子信息的理論數據庫；
使用LC-Orbitrap MS分析血漿樣本，用上述數據庫對樣本中的2-OHFAs和3-OHFAs化合物進行歸屬（通過對比其他脂肪酸類異構體的特征碎片離子，可以避免歸屬信息錯誤）；
根據碳鏈長度，C = C雙鍵數和羥基位置，構建與結構有關的保留行為預測模型，從而進一步證實OHFA的結構；
采用留一法進行交叉驗證法對模型預測的穩健性和預測準確性進行評估；
方法建立完成，用于食管鱗狀細胞癌患者（ESCC）血漿樣本檢測，發現生物標記物 。
實驗結果：
樣本提取方法：
對多種溶劑系統提取效果進行比對，最后選擇使用的提取方法為1μL血漿+300μL甲醇+800μL MTBE
2-OHFAs和3-OHFAs類物質的色譜分離
使用20種標準品來優化LC-MS/MS方法，如圖所示，標準品得到很好分離。從圖中可以發現在反相色譜中1. 3-OHFAs的出峰時間比起對應的2-OHFAs異構體出峰時間早；2. 兩類物質的保留時間隨著碳鏈長度的增加而增加，隨著雙鍵數的減少而增加。
總結碎片離子規律，建立數據庫
碎片規律：
2-OHFAs產生46.0049Da中性丟失；3-OHFAs通過麥氏重排產生碎片離子m/z 59.0138
基于上述規律，可以從理論上計算2-OHFAs和3-OHFAs類物質的碎片離子，通過計算，最終建立了一個in-house數據庫，包含碳原子數（4-26），C=C雙鍵數（不飽和度0-6），以及對應物質的母離子和子離子信息。
在血漿樣本進行檢測時，如果一個峰的質荷比與數據庫中記錄的數值偏差小于10ppm，那么這個峰將被添加至inclusion list中在PRM模式下獲取串聯質譜信息。
如果串聯質譜信息與數據庫中記錄的特征離子相匹配，那么該物質將被作為2-OHFAs和3-OHFAs候選離子。上圖顯示的就是血漿樣本中不飽和度為0和1的2-OHFAs和3-OHFAs物質，藍色表示已經經過標準品比對，紅色表示在HMDB數據庫中還沒有記載的新發現的羥基脂肪酸。
避免錯誤歸屬：
46.0049Da中性丟失和碎片離子m/z 59.0138并不是2-OHFAs和3-OHFAs的專屬特征信號，很多n-OHFAs或者環氧脂肪酸也具有這些特征。通過文獻檢索，可對羥基脂肪酸的碎片離子做如下總結：
對于羥基脂肪酸類物質來說， 碎片離子m/z 59.0138是3-OHFAs的特有離子，但是其對應的環氧或者環酮類異構體也可以產生此碎片。由于這類環氧或環酮官能團通常出現在脂肪鏈的中間位置，所以他們出來有m/z 59.0138碎片離子外，還有其他豐富的碎片離子。
2-OHFAs和ω-OHFAs（末端羥基脂肪酸）都可以產生46.0049 Da中性丟失作為主要碎片離子；其他羥基脂肪酸也可以產生該中性丟失，但是通常會同時產生其他的碎片離子。因此，2-OHFAs和ω-OHFAs可以通過碎片離子與其他羥基脂肪酸類物質進行區分。
羥基位置的不同，會導致色譜行為的差異，有報道顯示在反相色譜中ω-OHFAs比其對應的 2-OHFAs異構體出峰時間早，可以幫助我們區分 2-OHFAs和ω-OHFAs。
所以，要想區分羥基脂肪酸類物質，需要綜合考慮保留時間和碎片信息。
構建與結構相關的保留時間預測模型
要想確定2-OHFAs和3-OHFAs的結構，僅依靠一級質譜和串聯質譜信息是不夠的，而且之前總結的碎片離子并不是此類物質所特有，所以保留時間也是需要考慮的信息。OHFA的保留行為與其化學結構（包括羥基位置、碳鏈長度、C=C雙鍵數）有密切聯系。對于具有相同不飽和度的2-OHFAs和3-OHFAs來說，其保留時間隨著碳原子數的增加呈線性增加。
以3-OHFAs為例，此類物質的保留時間與碳原子數呈線性相關，相關系數為0.9933，使用該相關方程對六個物質進行預測，其結果與化學標準比對證實準確。
考察了保留時間與不飽和度之間的相關性，結果顯示C=C雙鍵數與保留時間呈線性負相關。
建立3D-模型用于不飽和3-OHFAs鑒定，3D圖中直觀地顯示了保留時間與其碳鏈結構的關系。
最終使用上述模型，在血漿中檢測到了32個3-OHFAs，其中20個為最新報道的物質。
同樣的，2-OHFAs也建立了相同的預測模型。需要注意的是，大多數的2-OHFAs候選物質都是飽和的，只有少數幾個物質含有C=C雙鍵，而且只有1個不飽和的2-OHFAs標準品，所以沒有辦法構建2-OHFAs不飽和度與保留時間的預測模型。但是，2-OHFAs的保留時間與其對應的3-OHFAs異構體的保留時間呈現很好的線性相關，相關系數R2=0.9999（圖5B），所以我們可以通過對應的3-OHFAs的保留時間推測2-OHFAs的保留時間，作者使用FA（18:1）-2OH標準品來驗證預測的準確性。
最終使用上述模型方法，作者鑒定了18個2-OHFAs，其中7個為新報道物質。
方法應用：
檢測ESCC患者和健康人血漿樣本中的2-OHFAs和3-OHFAs信息，尋找生物標記物，用于探究該類羥基脂肪酸在疾病過程中的變化。最后發現6個羥基脂肪酸類物質在ESCC患者中發生明顯改變，標明其與疾病的發生發展密切相關。
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